對酶庫進行有針對性的篩選是獲得新酶的有效途徑之一。分別以NADPH和NADH為輔酶，氢酶以N-Boc-3-呱啶酮(NBP0)為底物。合成在340nm對實驗室保存的醇脱催化還原酶庫進行高通量活力篩選。通過篩選發現，氢酶對NBP0具有還原活力的合成還原酶均為NADPH依賴型。進一步對有活力的醇脱催化還原酶進行立體選擇性分析，結果見表1。氢酶經過活力的合成篩選得到6種對NBPO具有一定催化活力的還原酶，立體選擇性較高的醇脱催化有4種：KpADH、CgKRl、氢酶PAR、合成Cg26。醇脱催化其中Cg26的氢酶立體選擇性為尺構型，其餘3種為S構型。合成考慮到適用於大規模的酶法製備，一些商業參數指標需要參考。例如生物催化劑載量，其決定反應過程中酶製劑的經濟效應。較高的比活力有利於生物催化劑在較低的載量下實現底物濃度載量上的生物轉化數,從而實現經濟高效的生物催化過程。同時，前期工作中獲得了KpADH的晶體結構並對KpADH的立體選擇性機製做了深入的分析，有利於後續的立體選擇性改造。從表1來看，KpADH較高的比活力在大規模的製備中更具有明顯的優勢。所以，選取來自尉Kluyveromycespolyspora的KpADH為後續研究對象。
具有應用前景的生物催化反應通常底物上載量應大於100g/L，故首先考察了KpADH對高濃度NPB0的耐受情況。根據文獻報道，NBPO為疏水性底物。因此,在10mL的反應體係中加入5％的乙醇助溶，並加入相同的酶量(200U)考察不同底物濃度對反應的影響。如圖1所示，隨著反應時間的增加，轉化率快速趨於穩定。當底物濃度為250mmol/L時，反應可實現完全轉化，然而在底物濃度分別為500mmol/L和1mol/L時，底物的轉化水平分別為390mmol/L和460mmol/L。底物濃度較高的兩個反應都快速終止在400mmol/L的轉化水平,且延長反應時間後轉化率並未得到改善。測定30℃KpADH的半衰期為80h，說明勳ADH的穩定性良好。但在加入底物反應1h左右,反應快速終止在400mmol/L的轉化水平，說明反應過程中較高的底物或產物濃度抑製了KpADH合成產物(S)-NBHP。該現象與之前報道的YDR541C在單水相催化中受到嚴重的抑製結果一致。說明可能是產物抑製導致的。因此，作者考察不同濃度的產物對不對稱還原反應的影響。
在1mL反應體係中加入相同酶量(0.015U)、相同的底物濃度(50mmol/LNBPO)和不同的產物濃度(0-250mmol/LNBPH)。考察不同產物濃度對KpADH催化還原NBPO反應的影響，結果見圖2。隨著產物濃度的增加，反應轉化率逐漸降低，直到反應轉化率接近3％，說明產物抑製是影響NBP0轉化反應的關鍵因素。
分別考察了不同濃度的底物和產物存在的條件下KpADH比活力的變化，並通過擬合獲得相應的動力學常數，見圖3。經過底物動力學測定，在高濃度底物的條件下KpADH的活力沒有明顯降低，Km值為(17.4±1.1)mmol/L，Vmax值為(88.3±2.2)μmol/(min·mg)，未發現明顯底物抑製的現象。在加入不同濃度的產物後，KpADH的比活力呈現不同程度降低，見圖3(b)的擬合曲線。通過抑製動力學擬合分析和0rigin軟件評估擬合結果，非競爭抑製方程的擬合程度最高，R-Square值高達0.98(R-Square越接近1，說明擬合程度越高)。獲得抑製常數民值為(459.9±118.6)mmol/L，Ki值為(9.9±1.0)mmol/L，Vmax-值為(83.9±2.9)μmol/(min·mg)。上述反應體係中加入助溶劑乙醇以增加產物的水溶性,當達到產物的抑製濃度後反應受到抑製而進入平台期。
經過擬合評估，該抑製類型屬於非競爭性抑製。這說明產物與酶的非活性部位相結合，形成產物和酶的絡合物後會進一步再與底物結合：或者是酶與底物結合形成底物和酶絡合物後，部分再與產物結合。雖然底物、抑製物(產物)和酶的結合無競爭性，但兩者與酶結合所形成的中間絡合物不能釋放產物，導致了酶催化的表觀反應速率降低。
據報道，NADPH依賴性的羰基還原酶YDR541C在單水相反應體係中進行NBP0(100～400mmol/L)的不對稱轉化，300mm01/L的NBP0可以在1h內完全轉化，由於產物抑製作用，400mmol/L的NBPO轉化率僅為81.7％。最終反應停留在300mmol/L的轉化水平。與還原酶PsCR一樣，在單水相體係中將4-氯-3-氧代丁酸乙酯(COBE)不對稱催化還原為(5)-4-氯-3-羥基丁酸酯(S)-CHBE)，當產物濃度達到120mmol/L時，反應速度急劇下降。作者通過動力學擬合分析，當達到抑製濃度400mmol/L時，產物與底物非競爭性地結合KpADH形成三元複合物，使KpADH構象改變，不能進一步釋放產物，導致酶活力下降。這種非競爭性抑製作用不能通過增加底物濃度來解除抑製。因此，在不同的底物濃度下硒ADH的轉化水平停留在400mmol/L。
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