香菇富含多種營養（包括維生素、外部蛋白質、环境脂肪酸、条件体产氨基酸、对香的影礦物質元素），菇原同時具有宜人的生质生率香氣，食之味道鮮嫩，量再口感絕佳，外部食用價值較高。环境香菇又被稱為冬菇或香蕈，条件体产在分類學中屬於擔子菌綱，对香的影傘菌目，菇原口蘑科，生质生率香菇屬，量再是外部一種為人們所喜愛的常見食用菌。中國是香菇消費和生產的大國，並且中國的香菇栽培規模也位列於世界的前端，然而在香菇的育種研究方麵卻有些許落後。所以，當務之急是香菇新品種研發以及原有品種的改良工作。
目前較為常用的育種手段是原生質體技術，這一技術能夠在一定程度上有效縮短食用菌的育種周期，但是，此項技術還未在全國範圍內進行推廣實施，目前由原生質體技術所派生出的育種技術主要有以下4類，原生質體誘變、原生質體轉化、原生質體融合、原生質體單核化。相對於其他育種方式而言，原生質體育種具有育種周期短、效率高的特點，同時對於食用菌的品質、產量以及抗性都有顯著的提升效果，進而提高香菇的育種水平。這個過程裏麵原生質體育種的基礎是原生質體的製備和再生。所以，本文重點研究外部環境條件對於香菇原生質體產量與再生率的影響，以此作為食用菌類的原生質體育種工作的參照。
1 材料與方法
1.1 供試材料
供試食用菌種：香菇（Letinula Edodes）遼撫4號編號0912，由撫順市農業科學研究院提供；母種培養基（克/升）：馬鈴薯200.0、蔗糖10.0、葡萄糖10.0、蛋白腖2.0、木屑150.0（煎汁過濾）、硫酸0.5、磷酸二氫鉀1.0、水1000.0、瓊脂粉12.0，培養基的酸堿度調整至5.5；再生培養基：與母種相同，外加穩滲劑進行定容。
穩滲劑配置：甘露醇、0.4摩爾/升的硫酸鎂、氯化鈉、氯化鉀，pH=5的蔗糖和葡萄糖液體。其他試驗試劑：0.22微米微孔濾膜過濾除菌，該試劑需要現配現用，酶液用對應穩滲劑配製酶濃度（W/V，重量體積比）1.0%的蝸牛酶，纖維素酶與混合酶（蝸牛酶∶纖維素酶=1∶1）。Cellulase（MP Biomedical）及Snailase（Wolsen）等為國產分析純。
1.2 試驗方法
原生質體數量統計：利用血球板進行計數，首先將原生質體稀釋至108，塗至平板上，然後按照公式：原生質體產量（個/毫升）=每格平均原生質體數×400×稀釋倍數×104進行計算。原生質體再生率（%）=[(再生平板菌落數-CK板菌落數）×稀釋倍數]/（塗布體積×原生質體濃度）×100方案設計：選取7個外部環境因素，考察這7個外部環境因素對香菇原生質體的產量以及再生率的具體影響。詳情見表1。
2 結果與分析
2.1 不同種類裂解酶原生
質體產量與再生率的影響如圖1所示，混合酶的酶解效果要比單一酶所產生的酶解效果好一些，混合酶作為酶解介質時，單位時間內原生質體的產量最高能達5.69×108個/毫升，此產量是蝸牛酶作為酶解介質原生質體產量的1.42倍，是纖維素酶作為酶解介質產量的4.15倍；混合酶作為酶解介質時，原生質體再生率是0.91%，蝸牛酶作為酶解介質的原生質體再生率為0.9%，達到了纖維素酶作為酶解介質時原生質體再生率的2.39倍。產生如此大差異的原因是，香菇自身的菌絲細胞壁組成成分比較複雜，因此，需要不同種類的酶共同作用，才能對其產生較好的降解作用。在此組試驗中，蝸牛酶是包含了澱粉酶、蛋白酶等20多種不同種類的酶於一體。因此，其酶解效果與混合酶一樣能夠較好的刺激原生質體的再生，但是纖維素酶成分比較單一，故而對原生質體的酶解效果一般。綜上研究，在後續的多因素試驗中會優先選擇混合酶作為介質。
2.2 酶解時間對原生質體產量與再生率的影響
通過圖2可以看出，酶解時間在3小時之內時，原生質體再生率與時間呈正相關的關係，隨著時間的增加，原生質體的產量也不斷增加。之後，原生質體的再生率則會出現下降。在整個酶解過程中原生質體產量從2小時後明顯上升，2.5小時後逐漸下降。回歸分後，可知酶解時間為2.82小時，原生質體再生率達到頂點1.7%；酶解時間為3.44小時，原生質體產量達到最高2.27×108個/毫升。
2.3 酶解溫度對原生質體產量與再生率的影響
原生質體的產量及再生率受溫度影響效果明顯，其中30℃是原生質體產量變化的臨界點，在這之前原生質體產量醉著溫度升高而增加，之後則出現明顯的下降。經過回歸方程計算可以得出，原生質體再生率在30℃達到最高，為1.08%，原生質體產量在29℃達到最高，為4.06×108個/毫升。分析其他酶解介質可以得出，蝸牛酶的最適酶解溫度範圍是30～37℃，纖維酶的最適酶解溫度為35℃左右，當溫度處於最適酶解溫度時，其對於菌絲體細胞壁的酶解效果最好。因此，菌絲的細胞壁分解效率較高。而對於混合酶來說，雖然在35℃時酶活性較高，但是較高的溫度會擾亂菌絲的內部代謝，影響細胞體內部穩定性，最終影響原生質體的產生。因此，當溫度高於30℃，原生質體的再生率和產量均出現了明顯下降。
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